ביו-וואדי | מדע כמו שמיכאל היה שואל

Маленький вирус приземляется на бактерию.

Не как блестящий космический корабль с драматичной музыкой. Скорее как взломщик с ножками от стола и манерами пылесоса. Он цепляется за стенку бактерии и впрыскивает внутрь DNA: листок инструкций, который пытается превратить клетку в фабрику по производству новых вирусов.

У бактерии нет мозга, нет темных очков секретного агента и нет сердитого домкома, который орет в подъезде. И все же у части бактерий есть трюк, будто написанный после слишком большого количества шпионских фильмов: они берут маленький кусочек DNA захватчика и сохраняют его внутри собственной DNA.

Это примерно как повесить на стену фото грабителя. Только стена сделана из живого кода, фото — это последовательность DNA, а грабитель — вирус, который пришел превратить тебя в копировальный аппарат. Биология, как обычно, берет странную идею и делает вид, что это обычная офисная папка.

В этот раз бактерия сохраняет фото

Вирусы, которые атакуют бактерии, называются фагами. Фагу не нужно быть большим, чтобы быть наглым. Он впрыскивает генетический материал, и бактериальная клетка может начать производить новые фаги вместо своей обычной бактериальной работы: жить, делиться и притворяться, что мир не полон крошечных игл с DNA.

В системе CRISPR некоторые бактерии сохраняют короткие фрагменты DNA прежних захватчиков. Эти фрагменты называются спейсерами. Они сидят между повторяющимися последовательностями DNA, как генетическая папка службы безопасности, набитая фотографиями подозреваемых. Такая папка в школе проверку рюкзака не прошла бы, но бактерии она может спасти жизнь.

Научный обзор, на который мы здесь опираемся, описывает CRISPR как часть адаптивной иммунной системы прокариотических организмов, то есть существ вроде бактерий, без клеточного ядра, как в наших клетках. Такие повторяющиеся последовательности нашли еще в 1987 году у бактерии Escherichia coli. Потом стало понятно, что промежутки между ними, спейсеры, могут происходить от вирусов или плазмид — маленьких колец DNA, которые умеют переходить между клетками.

Менее галстучными словами: то, что сначала выглядело как скучный узор обоев в DNA, оказалось архивом подозреваемых.

Коротко

Фаг — это вирус, который атакует бактерии и впрыскивает им DNA.
CRISPR начался как система памяти и защиты: бактерия сохраняет спейсеры от прежних захватчиков.
Cas9 — режущий белок, но направляющая RNA говорит ему, куда идти.
Программируемое редактирование генов — не магия: слишком похожий адрес может привести к разрезу не там, где нужно.

Когда сувенир начинает работать

Один сувенир взломщика не остановит. Фотоальбом не прыгает с полки и не валит кого-то на пол, разве что это особенно тяжелый семейный альбом.

Здесь память превращается в защиту. По обзору, эксперименты 2007 года поддержали защитную роль CRISPR: после встречи бактерий с фагами они встраивали новые спейсеры в свой геном. Потом их чувствительность к повторному заражению менялась в зависимости от того, какие спейсеры у них были.

То есть если в архиве бактерии есть кусочек, подходящий к захватчику, следующая атака не начинается с нуля. Клетка может сравнить то, что вошло сейчас, с тем, что когда-то сохранила. Для биологии это красивый момент, для вируса — неловкий: мы тебя уже видели. Не скучали.

Но все еще не хватает кого-то, кто выполнит действие. Папка с разыскиваемыми не бегает по коридору с наручниками. Кто берет память и превращает ее в разрез?

Записка, которая ведет ножницы

Тут появляется Cas9, белок, ставший звездой редактирования генов. Чтобы он не зазнавался: Cas9 — не гениальный ниндзя и не волшебник, который чует DNA с закрытыми глазами. Это охранник с ножницами. Серьезный охранник, но без записки довольно безынициативный.

В системе CRISPR-Cas9 типа II обзор описывает один центральный белок, Cas9, который работает с двумя типами направляющих RNA: crRNA и tracrRNA. crRNA — это адресная часть, последовательность, совпадающая с определенной DNA. tracrRNA — помощник, который позволяет системе использовать это наведение. Да, названия звучат так, будто кто-то заснул на клавиатуре. Смысл проще: один приносит адрес цели, второй помогает сделать наведение полезным.

А потом ученые сделали очень человеческую вещь: взяли сложную систему и сложили ей бумажки в одну стопку. Они сконструировали одну направляющую молекулу, single guide RNA, или sgRNA, которая соединяет двух проводников в одного. Менее элегантно, чем магия, зато намного практичнее.

Если изменить небольшой участок последовательности sgRNA, можно направить Cas9 к другой последовательности DNA. Вот он, момент программирования: Cas9 не стал умнее. Ему просто поменяли адрес на записке.

Inline image 2 - הפתק שמוביל את המספריים

Маленький бейдж у двери

Даже хорошего адреса мало. Cas9 должен увидеть рядом с целью короткий знак под названием PAM: последовательность из 2-5 пар оснований, которая находится рядом с местом разреза. В нашей охранной метафоре PAM — маленький бейдж у двери. Без бейджа охранник не должен начинать резать стены. Наконец-то бюрократия с пользой.

Когда направляющая RNA подходит и PAM найден, Cas9 может разрезать обе цепи DNA. По обзору, внутри Cas9 есть две режущие области: HNH режет комплементарную цепь, а домен, похожий на RuvC, режет некомплементарную.

Это не настоящие мультяшные ножницы. Это части белка, которые выполняют химический разрез. Но метафора держится: есть адрес, есть бейдж у двери, потом есть разрез. Только лист здесь не бумага. Это живой код внутри клетки.

Стоп, значит можно редактировать что угодно?

Здесь история становится более человеческой. Гены — это участки DNA, которые клетки используют как инструкции для строительства белков и управления клеточной жизнью. Редактирование генов — это попытка изменить этот код в конкретном месте. Не открыть секретное меню живого существа и выбрать цвет глаз, память пианиста и способность загружать посудомойку без жалоб. Скорее войти в одно предложение внутри огромной книги и попытаться исправить букву, не сбросив книгу со стола.

Именно поэтому CRISPR так важен для исследований. Если можно программировать направляющую RNA, можно отправить Cas9 проверять конкретное место в DNA. Это полезно ученым, которые хотят понять, что делает ген, создавать клеточные модели болезней и осторожно думать о будущих методах лечения.

Но программируемый не значит идеальный. GPS тоже иногда предлагает свернуть на парковку без выезда, а GPS, между прочим, не держит молекулярные ножницы.

Когда слишком похожий адрес портит дело

Если направляющая RNA достаточно похожа на неправильный адрес, Cas9 может разрезать не там, где мы хотели. Это называется off-target mutation: изменение вне цели. В DNA «достаточно близко» — плохая фраза. Примерно как курьер, который принес пиццу в соседний дом, только пицца — это молекулярные ножницы.

Обзор предупреждает, что неожиданные мутации вне цели являются проблемой безопасности при медицинском применении, потому что они могут нарушить работу клеток или сделать их опасными. Он также подчеркивает, что способ доставки в клетки и то, как долго Cas9 остается активным, могут влиять на нежелательные разрезы и иммунные реакции.

То есть вопрос не только в том, нашли ли мы ножницы. Вопрос в том, как завести их в правильную клетку, как долго они там остаются и успевают ли прекратить работу до того, как начнут вести себя как новый сотрудник, который слишком хочет впечатлить начальство.

Inline image 4 - כשכתובת דומה מדי עושה צרות

Что на самом деле проверяли?

Здесь на минуту выключаем трейлер и смотрим титры. Источник — рецензированный обзор 2017 года под названием CRISPR-Cas9: a promising tool for gene editing on induced pluripotent stem cells, авторы Eun Ji Kim, Ki Ho Kang и Ji Hyeon Ju, опубликованный в The Korean Journal of Internal Medicine.

Это обзор, а не исходный эксперимент, который превратил CRISPR-Cas9 в программируемый инструмент редактирования, и не клиническое испытание, доказывающее широкое лечение людей. Он суммирует механизмы и исследовательские идеи: повторяющиеся последовательности, найденные у E. coli в 1987 году, спейсеры, которые могут происходить от вирусов или плазмид, эксперименты 2007 года, поддержавшие защитную роль CRISPR, и описание Cas9, направляющей RNA, sgRNA, PAM и разреза двух цепей DNA.

Обзор также сосредоточен на индуцированных плюрипотентных стволовых клетках, iPSCs: взрослых клетках, которые ученые в лаборатории возвращают в более гибкое состояние, чтобы изучать болезни и проверять идеи для лечения. Это мощный исследовательский инструмент. Это не лицензия кричать, что завтра утром до бутерброда отредактируют любую болезнь.

Где магия заканчивается и начинается биология

CRISPR не доказывает дизайнерских младенцев. Это не медицинский совет. Он не означает, что каждый ген — одна кнопка, каждая болезнь — одна опечатка, а каждая клетка спокойно согласится, что кто-то вошел в ее код с ножницами.

Обзор описывает идеи редактирования соматических клеток, редактирования вне тела с последующим возвращением клеток, а также редактирования внутри тела. Но он снова возвращается к трудным проблемам: безопасность, доставка в клетки, эффективность, разрезы вне цели, иммунные реакции и регулирование.

Вопрос за столом: если бы вы строили охранника для DNA, в чем сделали бы его самым придирчивым: в адресе, в бейдже PAM или во времени, когда ему разрешено держать ножницы?

Так что отсюда забрать?

Бактерия из начала не пыталась получить Нобелевскую премию, решить всю медицину или спроектировать младенца с врожденным талантом раскладывать посудомойку. Она просто пыталась не стать фабрикой для следующего фага.

Для этого она сохранила кусочек DNA захватчика, использовала RNA как проводника, отправила Cas9 проверить адрес и PAM, а потом разрезала. Люди увидели эту крошечную систему безопасности и поняли ее блестящую и опасную часть: если заменить записку, можно отправить ножницы в новое место.

И вот фраза, которую стоит запомнить: CRISPR волнует ровно по той же причине, по которой настораживает. Ножницы программируемые. Теперь надо убедиться, что они стучат в правильную дверь.

Как бактерия повесила фото вируса на стену